Bu ürün bilgisi sayfası, tam manuel analiz ile denetimsiz bilgisayar analizi yaklaşımları arasındaki boşluğu kapatarak, akış sitometresi verilerinin kapsamlı ters evrişimi için Ağaç Diyagramını gözetimli bir yaklaşım olarak sunmaktadır. Kaluza Analysis Akış Sitometresi yazılımı kullanılarak Ağaç Diyagramları oluşturulması için adım adım talimatlar sağlanmıştır.

Manuel Akış Sitometresi Veri Analizi

Akış sitometresi verileri geleneksel olarak sıralı geçitleme ile analiz edilir. İşaretleyicilerin ekspresyonu, teker teker veya tek seferde iki tane olacak şekilde görüntülenir ve popülasyonlar, histogramlarda görüntülenen dağılımlardaki bahse konu geçitler olarak konumlandırılarak sübjektif olarak tanımlanır.

Bu ana geçitte bulunan tüm olaylar daha sonra diğer işaretleyiciler için ayrıca değerlendirilir ve daha fazla alt geçit tanımlanır, yalnızca ilgilenilen popülasyon kalana kadar analizden daha fazla sayıda olayı sıralı olarak hariç tutan bir geçitleme hiyerarşisi oluşturulur, bkz. Şekil 1.⁴

Boolean geçitleme, geçitteki olayların veya geçitlerin bir kombinasyonunun dahil edilip edilmeyeceğini belirlemek için AND, NOT ve OR (VE, DEĞİL ve VEYA) gibi mantıksal operatörleri kullanarak kullanıcının önceden tanımlanmış geçitleri birleştirmesine olanak tanır.

Şekil 1. Seçilen B Hücresi Alt Kümelerinin Sıralı Geçitlemesi. İnsan periferik kan örneği, IFU'ya göre DURAClone IM B Hücre Antikor Paneli (Parça NumarasıB53328) kullanılarak boyanmıştır ve CytoFLEX LX akış sitometresinde edinilmiştir. Veriler, Kaluza Analysis’de analiz edilmiştir. Hücre popülasyonları sıralı geçitleme ve Boolean geçitleme ile tanımlanır.

 

Her iki yaklaşım da kullanıcı tanımlı geçitlere dayanır ve son derece özneldir. Klasik geçitleme stratejilerinin yeniden üretilebilir özelliğini desteklemediği ve yüksek operatörler arası değişkenliğe sahip olduğu gösterilmiştir.⁵ Ayrıca, 10 renkli bir paneldeki tüm işaretleyici kombinasyonlarının kapsamlı bir incelemesi için 45 histogramın değerlendirilmesi gerektiğinden, çok fazla sayıda pratik yapma süresi gerektirir.⁷

Olayların hariç tutulması operatöre özel taraflılığa neden olabilir. Bu vakadaki veri analizi, yalnızca önceki bilgi ve geçit oluşturma stratejisini tanımlayan kişi tarafından yapılan varsayımlardan kaynaklanır. Literatürde daha önce açıklanmamış popülasyonlar veya istisnai işaretleyici ekspresyon paternleri kolaylıkla tanınmayabilir.³

İşlemsel Akış Sitometresi Veri Analizi

Yakın zamanda, boyut azaltma ve kümeleme teknikleri gibi işlemsel yaklaşımlar popüler hale gelmiştir. ViSNE ve FlowSOM (Şekil 2, SNE ve FlowSOM örneği) gibi algoritmalar taraflılık içermez ve hücre popülasyonları arasındaki önceden tanınmayan benzerliklerin keşfedilmesine olanak tanır.^2,7 Kümeleme algoritmalarının manuel geçitlemenin sonuçlarıyla eşleştiği ve daha fazla yeniden üretilebilirlik sağladığı gösterilmiştir.¹ Zaman alıcı olabilirler ancak manuel analiz ile aynı miktarda uygulama süresi gerektirmezler. Ayrıca, programlama becerilerinin çalıştırılmasını gerektirmeyen ticari olarak satılan çözümler, sonuçların inandırıcılığını kontrol etmeye yardımcı olabilecek uzman bilgisinin dahil edilmesini desteklemez.⁶

Şekil 2. Kaluza R Eklentisini Kullanarak İşlemsel Analiz. Kaluza R Console eklentisi kullanılarak DURAClone IM B Hücre Antikor Panelinin (Parça NumarasıB53328)işlemsel analizi. R Konsol eklentisi örnek dosyalarıyla birlikte verilen komut dosyaları CD19+ geçitli olaylarda çalışmak üzere uyarlanmıştır. A) CD45 dışındaki tüm floresans kanalları dahil olmak üzere bir tsne analizi gerçekleştirilmiştir. Sıralı geçitleme, tSNE kümelerinde renklerin geri geçitlemesine izin vermek için paralel olarak gerçekleştirildi. B) FlowSOM analizinden sonra CD19+ olaylarının yıldız diyagramları.

 

Akış Sitometresi Verilerinin Ağaç Diyagramı Görselleştirmesi

Kaluza Analysis yazılımı ile sunulan Ağaç Diyagramı, uzman bilgisi, kapsamlılık ve hız ile yönlendirilen analiz arasındaki boşluğu kapatır. Bir analize dahil edilen tüm olayların fiziksel özelliklerinin gözetim altında değerlendirilmesine olanak tanır. Beklenmeyen işaretleyici kombinasyonları kolayca görünür hale gelir. Ağaç Diyagramları, kullanışlı bir veri karşılaştırma aracı sağlar, çünkü bir Ağaç Diyagramı 28 adede kadar çift değişkenli diyagramdan elde edilen verileri birleştirebilir, böylece analiz stratejisi kurulduktan sonra veri yorumlama için gereken süreyi azaltır. Ağaç Diyagramı, geçitleme bilgilerine dayalı olarak olayları farklı sınıflara/popülasyonlara göre kategorileştirir. Olaylar, belirli bir geçit içinde yer alıp almadıklarına veya hariç tutulup tutulmadıklarına bağlı olarak bir sınıfa atanır. Ağaç diyagramı herhangi bir eksene sahip değildir ve bu nedenle eksen bilgisi yoktur. Bir ağaç diyagramında sınıflandırma için kullanılabilecek maksimum geçit sayısı sekizle sınırlıdır. Sınıfların sayısı, sekiz geçitle geçit sayısının sağladığı gücün 2 üssü olduğundan, tek bir ağaç diyagramı 256 popülasyonu görüntüleyebilir. Ağaç Diyagramları, hücre popülasyonları bir çift modal veya ikili ekspresyon paterni gösteren işaretleyicilerle karakterize edildiğinde özellikle etkilidir.

Şekil 3, Ağaç Diyagramın aşağıdakileri içeren bileşenlerini göstermektedir:

• Hücre popülasyonlarını belirli bir fenotipik veri türü için negatif veya pozitif sonuca sahip olmalarına göre kategorilere ayırmak için kullanılan Branches (Dallar). Branches (Dallar) diyagramın üst kısmında bulunur.
• Çubuklar, iki hücre popülasyonu arasında olası negatif/pozitif dal kombinasyonunun karşılaştırılmasını sağlar. Tree Plot (Ağaç Diyagram) için odak noktası, bu fenotipik sınıflandırma sisteminin resimsel bir temsili olan Bars (Çubuklar) öğesidir. Çubuklar, Count (Sayım) veya % Gated (% Geçitli) olarak görüntülenebilir.

Şekil 3. Ağaç Diyagramı Ekranı Birlikte Ekspresyon Modellerini Karşılaştırma. CD27 ve CD38'in birlikte ekspresyon paternlerini diyagramın dalları olarak karşılaştıran IgM/IgD- CD19+ hücrelerinin (mavi çubuklar) ve IgM/IgD+ CD19+ hücrelerinin (yeşil çubuklar) Ağaç Diyagramı görünümü. Veriler DURAClone IM B Hücreleri Antikor Paneli (Parça Numarası B53328) kullanılarak oluşturulmuştur.

 

Kaluza Ağaç Diyagramının Adım Adım Oluşturulması

1. Ağaç Diyagramınıza Dal veya Çubuk olarak dahil etmek istediğiniz her fenotipi görüntüleyen diyagramlar oluşturun, bkz. Şekil 4.

2. Her bir diyagram üzerinde, söz konusu fenotip için pozitif olan olayları içeren bir geçit oluşturun. Kaluza, fenotipi + ile dahil eden ve fenotipi - ile hariç tutan çubukları ve dalları otomatik olarak etiketleyecektir. Bu nedenle, geçidi CD işaretleyicileri için + veya – eklenmeyerek sadece popülasyon adıyla etiketlemek en iyisidir (Şekil 4).

Şekil 4. DURAClone IM B Hücre Antikor Paneli ile Popülasyonların ve Fenotiplerin Tanımlanması. Hücreler, DURAClone IM B Hücre Antikor Paneli (Parça Numarası B53328) kullanılarak IFU'ya göre boyanmıştır. A) CD19+ lenfositlerini tanımlamak için sıralı geçitleme. CD19+ popülasyonu giriş geçidi olarak kullanılacaktır. B) CD19+ lenfositleri IgM ve IgD ekspresyon seviyelerine göre ayrıca bölünür. Ağaç Diyagramından IgM- IgD+ ve IgM+ IgD- hücrelerinin dışlanmasına izin vermek için bir Boolean geçidi oluşturulmuştur. IgM/IgD geçidi, Ağaç Diyagramı çubuklarını tanımlamak için kullanılacaktır. C) Histogram diyagramları, CD38 ve CD27 ekspresyonunu görselleştirmek için oluşturulmuştur. Pozitiflik kesim tanımlanmasını kolaylaştırmak için, Lenfositler giriş geçidi olarak seçilmiştir. Pozitif ve negatif olaylar arasındaki kesimi işaretlemek için “Divider” (Bölen) geçit türü kullanılmıştır. Bölenin pozitif tarafı görüntülenen işaretleyicinin adıyla etiketlenmiştir.

 

3. Yeni bir Ağaç Diyagramı eklemek için, Plots & Tables (Diyagramlar ve Tablolar) şerit sekmesinden Ağaç Diyagramı simgesini seçin.

4. Diyagramın üst kısmında bulunan [Ungated] ([Geçit Oluşturulmamış]) hiperlinkini seçip açılır menüden dilediğiniz geçidi seçerek verilerinizi filtrelemek için (gerekliyse) bir giriş geçidi seçin.

5. Ağacın Branches (Dallar) öğelerini seçmek için () hiperlinkini kullanın. Branches (Dallar), Data Set (Veri Kümesi) içindeki herhangi bir geçit olabilir. Ağaca eklenen her bir Branch (Dal), geçit oluşturulmuş olayların, daha yüksek önceliğe sahip Branch(es) (Dal(lar)) içinde tanımlanan fenotipik özellik bakımından pozitif veya negatif olmalarına dayalı olarak daha fazla sınıflandırma sağlar. Renkler ve her bir bar ile özel olarak ilişkili pozitif/negatif fenotipik veri sınıflandırması dahil olmak üzere Bars (Çubuklar) lejandı, varsayılan olarak diyagramın alt kısmında bulunur.

6. Çubukları görüntülemek için uygun Y ekseni veri türünü seçin. Varsayılan ölçüm türü Count (Sayım) olarak belirlenmiştir. Ölçüm türünü % Gated (% Geçitli) olarak değiştirmek isterseniz, () hiperlinkini seçin ve açılır listeden % Gated (% Geçitli) öğesini seçin.

Şekil 5. DURAClone IM B Hücreleri Antikor Paneli için Ağaç Diyagramı Kurulumu. A) Yeni bir Ağaç Diyagramı oluşturuldu ve CD19+ giriş geçidi olarak seçildi. B) CD27 ilk dal olarak seçilmiştir. Bölücü geçitler, geçit listesinin Kadran kategorisinde bulunur. C) CD38 ikinci dal olarak seçilmiştir. Ağaç Diyagramı, artık CD27 ve CD38 ekspresyonunun olası kombinasyonları için 4'ünü de temsil eden çubuklar içermektedir. C) Çubuk olarak IgM/IgD eklendi. E) y ekseni ölçeği, Ağaç Diyagramı Radyali menüsü öğesine erişerek ve Renklendirme seçeneği seçilerek %Geçitli seçeneğine ve çubuklara atanan farklı renklere geçirildi.

7. Ağaç Diyagramda çubuk olarak görüntülenen herhangi bir popülasyonun daha ayrıntılı analizi için, bu olaylar Boolean geçidinin oluşturulmasıyla otomatik olarak çıkarılabilir. Ağaç Diyagramlarından Çubuklar öğelerini, diğer Ağaç Diyagramları dahil olmak üzere diğer diyagramlar için bir giriş geçidi olarak kullanabilirsiniz. Bir diyagramda Çubuk kullanarak geçit oluşturmak için Alt tuşuna basın, Çubuk öğesini seçip uygun diyagram üzerine sürükleyin ve işlemi tamamlamak için fare düğmesini bırakın, bakınız Şekil 6.

 

Şekil 6. Ağaç Diyagramından Boolean Geçidi Oluşturma. İnsan periferik kan örneği, IFU'ya göre DURAClone IM T Hücre Antikor Paneli (Parça NumarasıB53328) kullanılarak boyanmıştır ve CytoFLEX LX akış sitometresinde edinilmiştir. Veriler, Kaluza Analysis’de analiz edilmiştir. A) CD45RA+ CCR7+ CD4+ çubuğu (aqua), ALT tuşunu basılı tutarken seçildi ve CD27’e karşın CD28 nokta grafiğine sürüklendi (adım 1) ve bu görünüm sadece ilgili olayları gösterecek şekilde değiştirildi (adım 2). B) Seçilen çubuğu temsil eden bir Boolean geçidi, Boolean Geçitleri iletişim kutusunda gösterildiği gibi otomatik olarak oluşturulmuştur.

 

İpucu 1: Farenizi bir Bar (Çubuk) üzerinde gezdirdiğinizde, pozitif veya negatif sınırlandırma ile birlikte geçitlerin adları, söz konusu Bar (Çubuk) ile ilişkili Branches (Dallar) içinde görüntülenir.

İpucu 2: Ağaç Diyagramları, iki veri dosyasını birleştirerek ve Şekil 7'de gösterildiği gibi geçitlenmek suretiyle ayırarak iki örneği karşılaştırmak için de kullanılabilir.

 

Şekil 7. Kontrol ve Test Örneğini Karşılaştıran Ağaç Diyagramı. Kontrol örneği (mavi) ve test örneği (yeşil), zaman diyagramı ile gösterildiği gibi Kaluza’da birleştirilmiştir.  CD19+ olayları giriş popülasyonu olarak, ve CD27 ve CCR7 dalları olarak kullanılmıştır. CCR7 ve CD27 histogramları geçit yerleşimini göstermektedir.  Ağaç Diyagramı, kontrol örneğine (mavi) ve test örneğine (yeşil) çubuk şeklinde geçit %’sini karşılaştırır. Veriler Thomas Liechti, Huldrych Günthard ve Alexandra Trkola tarafından Sitometre Bölüm A'da oluşturulmuştur.⁸

 

Özet

Varsayımlara dayalı manuel veri analizi, veri incelemesi ve yeni popülasyonların keşfi için ideal olmasa da, tanımlanmış araştırma soruları ve bilinen hücresel alt kümelerin analizi için bugün hâlâ geçerlidir. Patentlenmiş Ağaç Diyagramı ile, Kaluza çok renkli verilerin hızlı ve kapsamlı ters evrişimi, istatistiksel sonuçların hızlı bir şekilde oluşturulması ve örnekler arasında karşılaştırma için bir araç sunar. Ağaç Diyagramları, çift modlu ekspresyon paternini gösteren işaretleyicilerin analizi için özellikle değerlidir.

 

Referanslar

1. Aghaeepour, N, Chattopadhyay, P, Chikina, M, et al. A Benchmark for Identification of Cellular Correlates of Clinical Outcomes. [Klinik Sonuçların Hücresel Korelasyonlarının Belirlenmesi için bir Ölçüt.] Cytometry Part A 2016:89(1). doi.org/10.1002/cyto.a.22732.
   
   
2. Amir, ED, Davis, KL, Tadmor, MD, et al. ViSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. [ViSNE, yüksek boyutlu tek hücreli verilerin görüntülenmesini sağlar ve löseminin fenotipik heterojenliğini ortaya çıkarır.] Nature Biotechnology 2013:31(6). doi.org/10.1038/nbt.2594.
   
   
3. Irish, JM. Hücresel keşif çağının ötesinde. Nature Immunology 2014:15(12). doi.org/10.1038/ni.3034.
   
   
4. Lugli, E, Roederer, M, Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: The future just started. [Akış sitometresinde veri analizi: Gelecek yeni başlıyor] Cytometry Part A 2010:77A(7). doi.org/10.1002/cyto.a.20901.
   
   
5. Maecker, HT, Rinfret, A, D’Souza, P, et al. [Başlık bulunamadı]. BMC Immunology 2005:6(1). doi.org/10.1186/1471-2172-6-13.
   
   
6. Reiter, M, Rota, P, Kleber, F, et al. Clustering of cell populations in flow cytometry data using a combination of Gaussian mixtures. [Gauss karışımlarının bir kombinasyonu kullanılarak akış sitometresi verilerinde hücre popülasyonlarının kümelenmesi] Pattern Recognition 2016:60. doi.org/10.1016/j.patcog.2016.04.004.
   
   
7. Saeys, Y, Gassen, SV, Lambrecht, BN. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. [İşlemsel akış sitometresi: yüksek boyutlu immünoloji verilerinin anlamlandırılmasına yardımcı olma] Nature Reviews Immunology 2016:16(7). doi.org/10.1038/nri.2016.56.
   
   
8. Liechti, T, Günthard, HF, Trkola, A. OMIP-047: High-Dimensional phenotypic characterization of B cells. [B hücrelerinin yüksek boyutlu fenotipik karakterizasyonu] Cytometry Part A 2018:93. doi:10.1002/cyto.a.23488.

 

Yalnızca Araştırma Amaçlı Kullanım İçindir.  Tanılama prosedürlerinde kullanmak için uygun değildir.