Tüm Diyagramları Ekle işlevini, Dağılma ve Logicle Slaytları kullanılarak veri ölçeklendirmesini ve Kaluza*’da akış sitometresi verilerinin floresans telafisini ayarlayın.

Veri Ölçeklendirmenin Önemi

Log ölçeğinde (Log) verileri görüntülerken, doğru bir şekilde telafi edilen akış sitometresi verileri yanlış bir şekilde fazla telafi edilmiş görünebilir çünkü negatif değere sahip olaylar, eksenler üzerinde yığılma eğilimi gösterir; bu bozulmanın nedeni, Log ölçeğinde negatif değerler bulunmamasıdır. Bu sorunu gidermek için Kaluza Analysis telafi edilmiş verileri doğru görüntülemenizi sağlayan Logicle ölçeğine (Şekil 1) sahiptir. Bir ekseni Log'dan Logicle ölçeğine geçirmek, ekseni iki farklı bölgeye böler, burada pozitif değerler Log ölçeğinde kalır ve negatif değerler Doğrusal ölçeğe dönüştürülür. İki farklı ölçek, her bir bölgenin genişliğini interaktif bir şekilde kontrol etmenizi sağlayan bir kaydırıcı ile ayrılır. Logicle ölçeği kullanıldığında negatif değerler, doğru telafi edilmiş değerlerde istenen simetrik görünüm korunarak doğru bir şekilde görüntülenir.

Bu uygulama notu için veriler DURAClone IM Phenotyping Basic Antikor Paneli* (Parça Numarası B53309) ile boyanmış, CytoFLEX LX akış sitometresinde elde edilmiş ve Kaluza Analysis Yazılımı* ile analiz edilmiş normal tam kan örneği kullanılarak oluşturulmuştur. Kaluza Analysis Yazılımı kullanımıyla ilgili detaylı talimatlar için, lütfen Kaluza Analysis Yazılımı Kullanım Talimatları’na (Parça Numarası C10986) bakınız. Bu uygulama notu, Kullanım Talimatlarının yerine geçmez.

Şekil 1. Log ve Logicle Veri Ölçeklendirme Karşılaştırması. Aynı veri kümesinin logaritmik ve logicle ölçeği örneği. A'daki oklar eksen üzerindeki veri noktalarını gösterir. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Florokromların belirlenmiş saptama kanalı dışındaki kanallara floresans dağılımı floresan telafisi ile düzeltilir. Telafi kalıntıları düzeltilmezse aşağı akış analizini olumsuz etkileyebilir (Şekil 2). Örnekler zaten uygulanmış olan telafisi matrisi ile elde edilse dahi, tüm örnekler için telafiyi kontrol etmek ve düzeltmek önerilir.

Şekil 2.  Telafi Sorunlarının Tespit Edilmesi. Gösterilen aynı veri kümesidir A) CD4-APC'nin APC-AA700 kanalına floresans saçılması aşırı telafi edilmiştir B) uygun şekilde telafi edilmiştir C) yetersiz düzeyde telafi edilmiştir. A ve C'deki oklar telafi artefaktını gösterir. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Add All Plots (Tüm Diyagramları Ekle) özelliği, tüm floresans parametrelerini birbirleriyle karşılaştırmak için hızlı bir şekilde diyagramlar oluşturmanızı sağlar. Bu, ölçeklendirme ve telafi ayarlaması yapmak için verilere genel bir bakış sağlayabilir. Aşağıda, çok renkli bir veri kümesi için veri ölçeklendirmesini ve telafisini ayarlamak üzere gerçekleştirilen olası bir iş akışını açıklayacağız.

Tüm Diyagramları Ekle

Add All Plots Options (Tüm Diyagramları Ekle Seçenekleri) menüsü, Add All Plots (Tüm Diyagramları Ekle) seçildiğinde eklenen diyagram ve geçit türlerini yapılandırmanızı sağlar. Yaptığınız tüm seçimler Kaluza tarafından hatırlanır ve Tüm Diyagramları Ekle simgesine tekrar tıkladığınızda otomatik olarak uygulanır.

• Plots & Tables (Diyagramlar ve Tablolar) şerit sekmesinde, diyagram sayfasına hangi diyagramların ekleneceğini belirlemek için “Add All Plots” (Tüm Diyagramları Ekle) simgesi üzerindeki aşağı doğru açılır oka tıklayın. Bu uygulama notunda özetlenen iş akışını takip etmek için, seçimleri Şekil 3'te gösterildiği gibi yapın.
  
  

Şekil 3. Tüm Diyagramları Ekle İşlevi.  Burada gösterilen örnek için kullanılan Tüm Diyagramları Ekle seçimleri eklendi. Diyagram türüyle geçit oluşturma diyagramını dahil et: Nokta ve Geçit Türü: Elips, sırasıyla FS Lineer ve SS Lineeri X ekseni ve Y ekseni dedektörleri olarak seçildi.

• Diyagramları oluşturmak için Tüm Diyagramları Ekle öğesine tıklayın. “A” popülasyonunu tanımlayan eliptik geçidi de içeren İleri ve Yan saçılımı karşılaştıran bir nokta grafiği oluşturulacaktır. Ek olarak, tüm floresans parametreleri popülasyon “A” üzerinde geçitlenmiş olarak birbiriyle karşılaştıran yoğunluk grafikleri görüntülenir.

Veri Ölçeklendirmeyi Ayarlama

Kullanılan sitometreye bağlı olarak, cihaz ayarları ve Kaluza’daki $CYT varsayılan ölçeklendirme ayarları, A geçidinin konumuna ve veri ölçeklendirmesine yönelik ayarlamalar gerekebilir (Şekil 4)


Şekil 4. Ayarlamadan Önceki ve Sonraki Tarih.  Panel A ve B, varsayılan ayarlar ile CytoFLEX LX akış sitometresi verilerini gösterir. C ve D Paneli, veri ölçeği, logicle dönüşümü ve A geçidinin konumu ayarlandıktan sonra aynı veri kümesini gösterir. Diyagramlar yalnızca örnek olarak sunum amaçlıdır.

• İleri ve Yana Saçılım Geçit Oluşturma Diyagramında Radyal Menüye erişin ve Veri Menüsünü açın.
• Yazılımın, eksenlerin üst ve alt görüntüleme limitlerini halihazırda toplanmış verilere dayalı olarak otomatik olarak ayarlaması için örneğin maksimum kanalın hiperlinkine tıklayarak veya Auto (Otomatik) öğesini seçerek Display Min / Display Max (Min. Görüntüle/Maks. Görüntüle) değerlerini (kanallar) değiştirin. Alternatif olarak, diyagramın bir bölümüne odaklanmak için Yakınlaştırma/Uzaklaştırma araçlarını kullanabilirsiniz.
  
  
  

Şekil 5. Veri Menüsü ve Maks. Görüntüleme A) Ayarlanmış Maks. Görüntüleme ayarı ile Veri Menüsü B) Yakınlaştırdıktan sonra Veri. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

• İlgilenilen popülasyonu dahil etmek için Geçit A'yı hareket ettirin. Çözünürlüğü gerektiği gibi ayarlamak için Görüntüleme Menüsünü kullanın.
  
  

Şekil 6. Geçitleme Diyagramı. A geçidinin ayarlanmış konumuyla Geçit Oluşturma Diyagramı. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

• Logicle dönüşümünü ve gerekirse tüm floresans kanalları için Maksimum Görüntülemeyi ayarlayın. 
  
  Logicle dönüşümünü ayarlamak için, ayarlamak istediğiniz diyagramı seçin, ölçeği negatif değerleri gösterecek şekilde ayarlamak için sol alt köşede görünen logicle kaydırıcı ile seçin ve sürükleyin (Şekil 7 A ve B).
  Maksimum Görüntüleme ayarını yapmak için, diyagrama sağ tıklayarak Radyal Menü öğesine erişin ve Veri Menüsü öğesini açın. Maksimum kanal değerini seçmek için Maksimum Görüntüleme öğesinin yanındaki Hiperlinki seçin veya Maksimum Görüntüle öğesini manuel olarak ayarlayın (Şekil 7 C ve D). Tüm floresans kanalları için tekrarlayın.
  
  
  

Şekil 7.  Veri Ölçeklendirme. Logicle ölçeğinin (A) ayarlamasından önceki ve (B) ayarlamasından sonraki veriler ve Maks. Görüntüleme ayarlamasından önceki veriler. D Paneli, Maks. Görüntüleme hiperlinkini gösterir. E) Uygun logicle dönüşüm ayarlarını uyguladıktan sonraki veriler ve Maks. Görüntüleme. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

• Yakınlaştırma aracı, diyagramın belirli bir alanını büyütmek için kullanılabilir.
  
  

Şekil 8. Veri Görüntüleme Araçları. Yakınlaştırma aracı belirli bir diyagram alanını büyütmek için kullanıldı ve Veri menüsü yeni Minimum ve Maksimum Görüntüleme ayarlarını görselleştirmek için gösterilir. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

BAŞARI İÇİN İPUÇLARI:

Belirli sitometre modellerinden elde edilen tüm veri dosyaları için kullanılan varsayılan ölçeklendirmeyi tanımlamak mümkündür. Bu, manuel ölçek ayarlamalarında zaman kazandıracaktır. Varsayılan ölçeği ayarlamak için, doğrusal saçılım ve logaritmik veya mantıksal olarak görüntülenen floresans parametreleri için istenen Min ve Maks değerleri ve floresan parametreleri ve logicle dönüşümü için Genişlik ile ilgili olarak gösterilen istenen dekat sayısını belirleyin. Genişlik ayarı negatif veri aralığının genişliğini ve doğrusallaştırılmış verilerin “dekatlardaki” aralığını belirler. Bu, panel tarafından optimize edilmelidir, ancak bir cihaz ve cihaz ayarları için uygun bir varsayılan değer seçilmesi gereken ayarlama miktarını azaltabilir.

• Kaluza simgesini ve Kaluza Seçenekleri öğesini seçin. 
• Kaluza Seçenekleri menüsünde, $CYT Varsayılanları sekmesine gidin. 
• Sol taraftaki panelde, ölçeklendirme varsayılanlarını ayarlamak istediğiniz cihazı seçin. 
• Ana yapılandırma alanında bulunan Parametre Ölçeği bölümüne kaydırın.
• Doğrusal, Log ve Logicle parametre ölçeklerini ya Default (Varsayılan) olarak ayarlayın ya da Min, Maks, Dekat ve Genişliği verilen aralık içinde istenen herhangi bir değere ayarlayın.
• Analizinize dönmek için Uygula ve Tamam'ı seçin.
  
  

Ölçek Modu
Kaluza 2 farklı Ölçek Modu sunar. Ölçek Modu, sitometre ile saptanan maksimum kanal sayısına bağlı olarak varsayılan diyagram ekseni ölçeği olan Tam Aralık ölçeğini 7 dekat olarak yapılandırır. Eski ölçek, 4 dekatlık veya maksimum 1024 kanal sayısına yeniden ölçeklendirilen verileri gösterir. Şekil 9'da iki Ölçek Modu ayarının bir karşılaştırması sunulmuştur.

Şekil 9. Tam Aralık ve Eski Ölçeklendirme Karşılaştırması. Tam Aralık ölçek modu (A) ve Eski mod (B) ile gösterilen aynı veriler gösterilmektedir. Popülasyonların görünümünün değişmediğini unutmayın. Eksen ölçeği farklı olabilir ve eksen ölçeğine göre değişiklikle örnekte gösterildiği üzere medyan floresans yoğunluğu gibi bazı floresan yoğunluğu ölçümleri vardır. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır.

Navios akış sitometresi (Eski) ve MoFlo Astrios hücre ayırıcı (Astrios ölçek modu) hariç olmak üzere, çoğu sitometre için varsayılan ayar Tam Aralıktır. Belirli bir sitometre modeli için varsayılan Ölçek Modu, Kaluza Seçeneği menüsünde seçilebilir. 

• Kaluza Seçenekleri menüsünde, $CYT Varsayılanları sekmesine gidin. 
• Sol taraftaki panelde, ölçeklendirme varsayılanlarını ayarlamak istediğiniz cihazı seçin. 
• Ana yapılandırma alanında bulunan Ölçek Modu bölümünün aşağısına ilerleyin.
• İstenen Ölçek Modunu seçin
• Analizinize dönmek için Uygula ve Tamam'ı seçin.

$CYT varsayılan ayarlarında yapılan tüm değişiklikler, değişiklik yapıldıktan sonra Kaluza’ya yüklenen veri kümeleri için geçerli olacaktır. Analiz Listesi’nde halihazırda bulunan veri kümelerini etkilemeyecektir.

Ölçek Modu ayrıca Analiz Listesi içinde verilen belirli bir analiz için de seçilebilir. Edinim yazılımında gözlemlenenden sabit bir faktöre göre farklılık gösteren ortalama floresans ölçümleri gibi beklenmedik sonuçlar gözlemlenirse, ölçek modunu kontrol edin ve uygunsa değiştirin. Ölçek Modunu Analiz temelinde değiştirmek için, bir Analiz veya Kompozit içindeki tüm sayfalar ve veri kümelerini değiştirmek için: Analysis List'te (Analiz Listesi) Analysis (Analiz) öğesine sağ tıklayın, Protocol Scale Mode (Protokol Ölçeği Modu) üzerine fareyle gidin ve istenen Scale Mode (Ölçek Modu) öğesini seçin

NOT: Çoklu dosya analizi için bir Kompozit oluşturulduğunda, ölçek modu tüm veri kümeleri için otomatik olarak tam aralığa değiştirilir.

Telafi Ayarlama

Spillover Sliders (Dağılma Kaydırıcılar), diyagramlarda gerçek zamanlı görsel işaretler kullanarak floresans Dağılma telafisi yapmanızı sağlar. Kaydırıcılar uygulanabilir tüm diyagramlar üzerinde oluşturulabilir. Kaluza’da telafi matrisini değiştirmeye yönelik diğer seçenekler için lütfen Kaluza Analysis Akış Sitometresi Yazılımı IFU C10986’ya başvurun.

Spillover Sliders (Dağılma Kaydırıcıları) kullanmak için:

• Gates & Tools (Geçitler ve Araçlar) şerit sekmesinden Compensation [Telafi] simgesini seçin. Geçerli diyagramlar artık diyagram kaydırıcılara sahiptir (Şekil 10 A).
• Spillover Sliders (Dağılma Kaydırıcıları) özelliğini kullanarak Spillover (Dağılma) güncellemesi yapmak için kaydırıcılardan birine, istenilen değişiklik yönünde tıklayın. Spillover (Dağılma) değeri kaydırıcının yanında, Şekil 10 B ile gösterildiği şekilde görüntülenir.

Spillover (Dağılma) üzerinde kademeli ayarlamalar yapmak için:

• %0,1’lik artışlarla hareket ettirmek için: Kaydırıcının her iki ucunda bulunan uygun oku seçin.
• Ok her seçildiğinde kaydırıcı kolu %0,1 kadar hareket eder. Bu değişim, Telafi bölmesinde de görüntülenebilir.
• %1’lik artışlarla hareket ettirmek için: Kaydırıcı çubuğuna tıklayın. Kolun hangi tarafına tıklarsanız kaydırıcı o yönde 1% hareket eder.

NOT: Spillover Sliders (Dağılma Kaydırıcıları), 0 ve 100% arası değerlere izin verir. Bu aralık dışındaki ayarlama değerleri manuel olarak Telafi bölmesindeki Spillover Matrix (Dağılma Matrisi) öğesine girilmelidir.

Ölçek ve telafi ayarlandıktan sonra veriler analiz edilmeye hazırdır:

Şekil 11. Ayarlama Sonrası Görsel Doğrulama. Ölçek ve telafi ayarlamalarından sonra tüm floresans işaretleyici kombinasyonlarının görselleştirilmesi. Diyagramlar yalnızca gösterim amaçlıdır