Daha önce başarılı bir akış sitometresi deneyi için önemli olan ve şu üç temayı içeren unsurları yayınladık:
“Akış Sitometresinde Analiz Tutarlılığı” — Geçitleme, görüntüleme, analiz yinelemeleri ve veri iletişiminde tutarlılık sağlamak için Cytobank işlevlerinin kullanılması
“Güzel Diyagramlar Oluşturmak: Veri Görüntülemenin Temel Özellikleri” — Akış sitometre deneylerinde uygun diyagram türlerini, etiketlemeyi, telafiyi seçme ve ölçek ayarlarını doğru şekilde ayarlama
Bu sefer, bir akış sitometresi deneyi tasarlarken ve yürütürken göz önünde bulundurulması gereken başka bir grup hususu inceleyeceğiz. Bu temalar kişisel çalışma deneyimimizden, Cytobank kullanıcılarına analizlerinde yardımcı olurken elde ettiğimiz deneyimlerden ve büyük klinik veri kümelerinin analiz edilmesinden elde ettiğimiz içgörülerden dolayı ortaya çıktı. Bu paylaşımda, kısa bir genel bakış sunacağız, bu nedenle bu konuların her birini daha detaylı açıklayan gelecekteki paylaşımlar için bizi izlemeye devam edin.
1. Antikorlarınızı titre edin
Bir deney gerçekleştirmeden önce, her zaman reaktiflerinizi tanıyın. Sinyali maksimuma çıkarmak ve arka plan boyamasını en aza indirmek için antikorlarınızı titre edin. Çok az antikor eklenmesi, antikor boyanmamasına ve hedefinizi boyamaya neden olabilir veya negatif bir popülasyondan zayıf bir ayrımınız olabilir. Çok fazla antikor eklenmesi, hedefiniz için aslında negatif olan hücrelerin arka plan boyama düzeyini artırır. Bir pozitif sinyalin optimum şekilde nasıl tespit edileceğini belirlemek için antikor konsantrasyonlarını adım adım arttırarak boyama yapmanız daha faydalı olacaktır.
2. Bir antikor anakarışımı yapın
Bir boyama panelinin en az belirli kısımlarını paylaşan birden fazla tüpü boyarken, örnekler arasında dağıtmak üzere her zaman bir antikor anakarışımı hazırlayın. Bu, pipetleme varyansını en aza indirir ve örnekler arasında tutarlılık sağlayarak örnekler arasında karşılaştırmalar yapmanıza olanak tanır. Mümkün olduğunda tek tek tüplere ayrı antikorlar eklemekten kaçının.
3. Uygun kontrolleri hazırlayın
Sorduğunuz soruları ve bu soruları yanıtlamak için ihtiyaç duyacağınız kontrolleri düşünün. Seçtiğiniz kontroller ile neleri sonuçlandırabileceğinizi düşünün. Örneğin, boyanmamış/uyarılmamış hücrelerin boyalı/uyarılmış hücrelerle (veya floresans-eksi-bir (FMO) kontrolleri kullanılarak) karşılaştırılması, bu durumda sinyal büyük ölçüde arka plan boyamasından etkilendiğinden dolayı (ve antikor titrasyonunuzun sonuçlarından büyük ölçüde etkilendiğinden) bazal sinyalizasyon hakkında sonuç çıkarmanıza izin vermeyecektir. Temel sinyalizasyon gibi biyolojik soruları ele almak için biyolojik kontrollere ihtiyacınız olacaktır. Aşağıdakilerin kombinasyonlarını öneriyoruz:
- İnhibitör ekleyin ve sinyali azaltın (dikkat: inhibitörler düşündüğünüzden başka bir şey üzerinde etkili olabilir).
- Fosfataz ekleyin ve sinyali azaltın (dikkat: hücrelerinizdeki tüm fosforları kaldırırsanız, hedef dışı bağlanma, spesifik olmayan bağlanma ve arka plan da azalacaktır).
- SiRNA ekleyin ve antikorun gerçek hedefini çıkarın (harika kontrol, ancak aşağı inme asla %100 değildir, hücrelere girmesi zordur ve hücre biyolojisini istenmeyen şekillerde etkileyebilir).
- Endojen fosfatazların oluşmasını ve sinyalinizin biyolojik sıfıra inmesini sağlayacak kadar uzun bir süre boyunca stimüle edin (dikkat: en alta ulaştığınızı bilmenin bir yolu yoktur).
- Sadece ilgilenilen tek genin eksik olduğu genetik olarak eşleşen hücrelerle karşılaştırın (transjenik çıkış + hedefin arkasını ekleyin). Bu, tek iptal edilemez kontroldür. Burada dikkate alınması gereken en önemli husus, bunu çoğu insanın genetik olarak eşleşmiş (kritik öneme sahip) yapmamasıdır, bunun yerine, genin diferansiyel ekspresyonuna sahip iki hücre dizisi bulabilir ve hücreler hakkında başka hiçbir şeyin farklı olmadığını varsayabilirler.
- Pek çok örneğe bakın ve bazı örneklerin çok düşük bazal, diğerlerinin ise çok yüksek olduğunu gösterin (bazal farklılıklar için tartışmak için doğal varyasyonu kullanın; dikkat: insanlar örnekten örneğe boyama farklılıklarından şüphelenecektir, bu nedenle diğer şeyler değişirken, bazı şeylerin örnekten örneğe değişmediğini göstermek önemlidir).
Bir stimülasyonun neden olduğu sinyalizasyon miktarını ölçmek ister misiniz? Uyarılmış/boyanmış olan ile karşılaştırmak için uyarılmamış/boyanmış olanı dahil edin.
Bir çalışma içindeki örnekler arasında karşılaştırmalar yapmak için istatistiksel değerleri normalleştirmeniz mi gerekiyor? Kat değişimi karşılaştırmaları için kontrol olacak bir örnek seçin (ör. bir sağlıklı örneğin bazal ölçümünü diğer sağlıklı örnekler ve diğer kanser örnekleri için referans noktası olarak seçin).
Uygun kontrolleri seçmek size zaman, para ve çabadan tasarruf sağlayacaktır. Bu adımı çok dikkatli düşünün! (Gelecekte bu konu hakkında daha detaylı bir gönderi için bizi izlemeye devam edin.)
4. Referans olarak öngörülebilir bir örneğin dahil edilmesi
Yeni bir deney yürütürken, bilinen bir sonucu olan bir örneği dahil etmek iyi bir fikirdir, böylece stimülasyon ve saptamanızın etkinliğini değerlendirmek için bir referans noktası olarak kullanabilirsiniz. Bu, şaşırtıcı sonuçların anlaşılmasına ve bir şeyler ters giderse sorun gidermeye yardımcı olacaktır.
5. Reaktifleri değiştirmeme
Bir deney içindeki dosyaları veya bir grup içindeki deneyleri bir normalizasyon referansı kullanarak karşılaştırmak istiyorsanız reaktifleri değiştirmediğinizden emin olun. Bir reaktif biterse floroforları benzer emisyon spektrumlarıyla değiştirme eğiliminde olsanız da (veya tamamen farklı olanları kullansanız da) dosyalarınız artık doğrudan karşılaştırılabilir olmayacaktır (özellikle tandem boyaya veya tamamen farklı bir florofora/kanala geçerken geçerlidir). Farklı floroforlar farklı yoğunluklara ulaşır, farklı stabiliteye sahiptir ve farklı kanallara farklı şekilde akar.
6. Telafi kontrolleri için taneciklerin kullanılması
Araştırmacılar çoğu zaman deneylerinde kullanılan antikorların aynısını tek boyalı telafi kontrolleri için kullanmayı tercih eder. Bazen çalışmada kullanılan hücreler, belirli bir antikorla bağlanan hedefi bol miktarda eksprese eder ve diğer zamanlarda bağlanma ya zayıftır ya da mevcut değildir. Antikorları bağlayan tanecikleri kullanarak tek boyalı telafi kontrolleri oluşturmada tahminlerde bulunmayı ortadan kaldırabilirsiniz (ör. IgG bağlayıcı tanecikler tüm IgG antikorlarını bağlayarak sinyal vermenizi sağlar). Antikor bağlayıcı tanecikler, telafi kontrolleri arasında tutarlılık ve homojenlik sağlar.
Çok deneyli veri kümeleri (ör. büyük hasta kohortları) için bazı ekstra ipuçları...
7. Deney dosyalarını tutarlı bir şekilde adlandırın
Dosyaları adlandırmak ve tutarlı adlandırma ile deney yapmak, verilerinizin düzenli tutulmasına yardımcı olur, analiz hatalarını önler ve deney dosyası adlarında bulunan tutarlı anahtar kelimeleri kullanarak verileri toplu olarak manipüle edebilen aşağı yönlü biyobilişimsel yaklaşımları kolaylaştırır.
8. Sitometre kalibrasyonu
Bir şablon ve tanecikleri kullanarak her çalışmadan önce akış sitometresi lazerlerini kalibre etme; hedef, her bir çalışmadan önce taneciklerin aynı diyagram şablon kutusuna geldiği noktaya kadar lazer gücünü artırmaktır. Her çalışmadan önce bunu yapmak için 5 dakika ayırmanız, ileride daha fazla karşılaştırılabilir şekil oluşturmanıza yardımcı olacaktır. Tüm deneylerde aynı ölçek ayarlarını kullanabilme olasılığınız daha yüksektir ve hatta bu garanti edilmese de aynı telafi matrisini de kullanabilirsiniz. Güzel Çizimler Yapmak: Veri Görüntülemenin Temelleri gönderimizin “Ölçek ayarları” bölümünü okursanız, ölçek ayarlarını ayarlamak için tek boyama telafi kontrollerinin nasıl kullanılacağını görebilirsiniz; sitometre kalibrasyon ayarları günden güne yeterince benzer ise birden fazla deneye uygulanıp uygulanamayacaklarını görmek için, birden fazla deneyden gelen telafi dosyalarını birleştirebilir, bir test telafi matrisi uygulayabilir ve ölçek ayarlarını ayarlayabilirsiniz.
– Angela
